丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

谢怡 尹有宽 张继明

谢毅因有宽的章记名。

丙型肝炎病毒，又称C病毒，属于黄病毒科下的丙型肝炎病毒属。这种病毒呈单股正链RNA结构，其基因组全长大约为9.4千碱基对。具体来说，它包括一个341碱基对的5'非编码区（5' URT），一个编码约3011个氨基酸的长开放读框，以及一个大约27碱基对的3'非编码区（3' URT）。在病毒复制过程中，氨基端存在三个蛋白质，分别是C、E1和E2/NS1，而羧基端则有四个蛋白质，包括NS2、NS3、NS4和NS5。由于RNA复制酶的低保真度以及缺乏校正机制，丙型肝炎病毒表现出极高的异质性；这种异质性不仅体现在不同地区和不同患者的病毒分离株上，即使在同一患者的不同病程阶段，其病毒分离株在核苷酸序列和氨基酸序列上也会出现显著的差异。本文就丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义作一综述：

1 HCV基因分型分类系统

自1991年Choo等人成功分离出HCV的完整基因组以来，全球范围内陆续发现了多种HCV分离株。通过对已发表的HCV序列进行对比分析，我们发现不同基因型之间的全基因组序列存在显著的差异。众多研究者各自建立了自己的HCV分类体系，其中主要的命名系统包括：

该系统依据病毒基因组的核苷酸序列相似度，建立了HCV基因型的分类命名体系。该体系按照基因型发现的顺序，用阿拉伯数字进行编号；而在同一基因型内，不同的亚型则按照发现的顺序丙肝基因分型检查不出来，用小写英文字母进行区分。

在基因组全序列分析的过程中，我们采用了I、II、III、IV等符号来标识不同的基因型。然而，这种分类方法并未考虑到亚型的存在，因此无法准确体现不同基因型之间的差异程度。

在HCV基因分型研究方面，我国是先行者。我们首次在美国发现的HCV基因型被命名为原型（，PT）或美国型（HCV—US，HCV．1），而日本株则被命名为K2a或K2b。

研究人员采用了多样化的分类体系及方法，这导致了命名的不一致性，并缺少一个统一的鉴定准则，使得与其他实验室的研究成果难以进行对比和参考。鉴于此，在第二届HCV及相关病毒国际讨论会上，确立了一个统一的命名体系，这一体系与之前的命名体系存在一定的对应关系（详见表1），并且已被广泛应用于后续的HCV基因型及亚型研究中。

表1 HCV基因不同分类系统的比较

一： 未分类

目前公认存在六种HCV基因型以及多种亚型，这些基因型间的全基因组序列差异可高达35%；而不同亚型之间的差异则大约在75%至86%之间。此外，HCV基因型和亚型的地理分布也呈现出相对的流行差异，它们在全球不同地区间的流行情况各不相同。1a和1b型基因型在美国及欧洲较为普遍；在日本，1b型基因型在HCV感染病例中占比高达73%；而在北美、欧洲和日本，2a和2b型基因型较为常见；2c型基因型主要在意大利北部地区较为多见；3a型基因型在欧洲和美国的吸毒者群体中较为流行；4型基因型在北非和中东地区较为盛行；5型和6型基因型则主要分布在南非和香港地区；7、8和9型基因型仅在越南患者的样本中被检测到；10型和11型基因型则主要在印度尼西亚患者的样本中出现。部分学者提出，7至11型属于6型的变体，在我国大陆，仅存在lb型和2a型两种，其中以lb型为主流。当观察至南方城市，如南京、南宁、成都等地，lb型所占比例高达90%以上；而在北方城市，如哈尔滨、沈阳、兰州等地，2a型所占比例介于46%至70%之间。尽管基因型多样性不及香港、台湾及日本，但混合感染率却显著高于其他国家和地区。

3 HCV 基因分型方法

基因分型的分子学技术，在深入探讨HCV基因分型在不同地域的分布特点、疾病症状以及治疗反应差异的基础上，构建一种稳定可靠的HCV基因分型技术，已成为临床研究领域的关键议题。一种既标准又精确的HCV基因分型方法，包括使用PCR技术对患者的HCV基因组进行扩增，然后对其进行测序和系统学分析。但是，这种直接测序方法的工序太复杂，用于普查是不可行的。

3.1.1 型的PCR技术主要针对从临床样本中提取的HCV RNA进行扩增，随后，通过使用具有特异性的引物或探针进行进一步的扩增。研究人员首次采用了特异性引物对HCV基因进行分型，所使用的引物针对的是核心区域的特异性序列。此方法仅能识别出la、lb、lc、2a、2b以及3a等类型；经过优化后，其敏感性和特异性有所提升，然而，与其他检测手段相比，其效果上的差异尚无确切结论。

对从临床样本中提取的HCV RNA进行扩增时，采用限制性片段长度多态性分析（RFLP）技术。此技术涉及运用能够识别特定基因位点的核酸限制性内切酶对样本进行酶切处理。具体操作是，利用这类限制性内切酶将经过PCR扩增的DNA片段切割成不同长度的小片段。

比利时研发出一种针对HCV基因分型的试剂盒，该方法称为线探针杂交法（LIPA），它专门针对5'非编码区的型特异性探针进行分型。该试剂盒现已在临床中得到广泛应用。然而，由于5'非编码区相对较为保守，导致对某些亚型的区分效果不佳。最初版本的试剂盒敏感性不高，无法准确区分5％～10％的la和lb病例，同样也无法区分2a和2b病例。这款新型试剂盒具备辨别能力，能够识别HCV的亚型，包括la、lb、2a至2c、3a至3c、4a至4h、5a以及6a。

表2 HCV基因分型试剂盒比较

Table 2 of kits of HCV

1993年，研究者们提出了系统进化树方法，该方法用于对全基因组进行对比分析，结果显示基因间的同源性在各个型别之间为56％至72％，而在亚型之间则为74％至86％；该方法不仅能区分几乎所有已知的基因型和亚型（详见表2[61]）丙肝基因分型检查不出来，还能揭示新的型和亚型。目前，选择对NS5b区进行PCR扩增，并对其进行进化树结构分析，已成为公认的基因分型“黄金标准”【2】。这些方法均能准确识别主要的基因型类别，然而，在亚型区分方面，唯有核苷酸直接测序表现出显著效果。此外，以PCR为基础的分型技术各有利弊。型特异性引物PCR和RFLP技术在灵敏度和特异性上略逊一筹。LIPA法在区分某些亚型时存在局限。而系统进化树分析法耗时较长，需要专用设备以确保结果精确，同时还需注意防止污染。在临床实际应用中丙肝基因分型检查不出来，可将各种方法结合使用，以起到互补作用。

研究者成功分离出一种特定基因型抗体，该抗体可作为HCV基因分型（即血清分型或血清学基因分型）的间接证据。这种血清学基因分型方法因其优势而适用于大规模流行病学研究，其优势在于污染风险较低，实验操作简便。尽管如此，血清学分型在敏感性和特异性方面存在不足，具有一定的局限性。在1989年，Kuo等人通过运用HCV重组抗原（Cl 3）成功构建了首个血清学分型技术，即放射免疫法（RIA）。然而，这种技术存在放射性污染问题，且操作流程复杂，因此很快被EIA和RIBA所替代。

重组免疫印迹试验（RIBA）由Corp所提出，采用了一种名为RIBA SIA的方法。该方法涉及从HCV NS4片段中提取的五个具有血清学特异性的多肽序列，以及从HCV基因组核心片段中提取的两个具有血清学特异性的多肽序列。通过这些序列，可以区分HCV的基因型1、2和3型。

3.2.2 酶联免疫测定（EIA）是Murex公司提出的针对丙型肝炎病毒（HCV）血清分型的酶联免疫实验。该实验通过NS4编码的多肽激发出对基因型1至6具有特异性的抗体，从而实现不同基因型的区分。将此方法与另一种方法进行对比，发现对于基因型1、2和3的鉴定，两者的一致性高达96%。然而，血清学检测无法确定感染是否为近期发生，且对于储存不当导致RNA降解的血清或已清除病毒败血症的样本，其检测效果亦不理想。

血清检测，无疑是一种理想的选择。在分析众多样本，例如检测HCV的传播途径、某一地区流行的病毒型别时，采用血清学分型技术不仅快捷方便，且所需用量不多，即便是常规的实验室也能轻松操作。Beld等人的研究结果表明，对于感染了la型的具有免疫活性的个体，血清学分型技术展现出极高的可靠性。该方法在针对基因型3a型病例及伴有HIV感染的案例中表现出较低的敏感性，这表明其存在一定的局限性。尤其是在基因型la型不普遍的区域内，这一局限性尤为明显。

该方法在针对感染了HCV基因型6型的患者时表现出的敏感性不佳。美国学者指出，血清学基因分型与分子学基因分型之间呈现出高度的一致性。然而，这些实验在可靠性方面存在差异，其根本原因在于HCV基因分型在不同地区存在分布上的差异。选择HCV分型技术时需考虑实验室或研究机构的具体需求，若目标是鉴定所有亚型或检测新型序列，则应采用PCR扩增技术，随后进行测序分析。然而，在治疗相关实验中，上述任何一种方法均可采纳，关键在于区分感染HCV 1型病毒的患者与其他类型病毒感染者。

4 HCV基因分型的临床意义

HCV基因的流行病学分布存在地域性差异，故在HCV在人群中出现流行时，基因分型分析便成为追溯其来源的关键手段。HCV主要通过直接接触患者的血液进行传播，而通过对不同人群的HCV分子学深入研究，包括垂直传播和性传播在内的其他传播途径也引起了广泛关注，并且研究证实，HCV在结肠镜检查过程中，患者之间也可能发生传播。Zein等人研究发现，HCV基因分型与研究对象并无直接联系，然而众多研究者却确认了这种联系的存在。他们指出，3a型和1a型在静脉注射毒品者中较为常见，而1b型则多在HCV通过血制品传播的情况下出现。这一发现进一步证实了基因分型在追踪HCV流行源头方面具有至关重要的价值。

HCV感染的确诊主要依靠对献血者血清中抗HCV抗体的检测来筛选，这是目前遏制HCV传播的重要手段。然而，这种筛选的成功与否，很大程度上取决于不同分离株之间序列变异的幅度。第一代HCV检测抗原是由HCV基因1型NS4区编码的5—1—1和C.00.所构成，而那些不与这些抗原发生交叉反应的基因型则可能被遗漏。第二代HCV检测抗原中引入了较为保守的C区抗原，而第三代检测试验在第二代的基础上进一步扩充了NS5区的抗原检测；这一改进显著提升了检测的灵敏度与特异性。

异性关系，可以减轻基因分型对结果的影响。目前，HCV RNA逆转录PCR扩增技术正逐渐成为诊断HCV感染及为患者实施个体化治疗所不可或缺的检测手段。这项技术的主要优势在于能够对急性感染和病毒血症进行早期诊断，然而，其敏感性却受到引物选择及多种因素的影响。

标本处理对病毒血症水平的影响显著。在HCV病毒血症水平的定量分析中，这一技术已被应用于干扰素治疗患者的筛选和疗效评估。目前，评价HCV RNA的方法主要有两种：一种是罗氏公司开发的诊断系统，该系统基于HCV RNA的定量竞争性PCR技术；另一种则是针对特定变异目标进行再次扩增的方法。这两种技术都能对丙型肝炎病毒RNA进行精确的测量，且其结果既稳定又一致。

感染了丙型肝炎病毒后，大多数（占80%）的患者无法自行清除病毒丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义，转而发展成慢性肝炎。有研究者探讨了基因分型在急性感染向慢性丙型肝炎转变过程中的作用，结果表明，92%的1b型急性感染患者会演变成慢性，而其他类型的患者这一比例仅为35%至50%。这一现象已经引起了学术界的广泛关注。有人持观点，细胞免疫与体液免疫在自我清除过程中扮演着重要角色，然而这一观点尚未得到充分证实。另一些人则推测，病毒基因的显著变异可能是免疫逃逸的原因，亦或是病毒载量较低导致机体中的CTL细胞反应过于微弱。

关于HCV基因分型与肝脏疾病严重程度之间的联系，目前尚未有明确的结论。部分文献指出，在患有慢性HCV的群体中，lb型引发的肝脏病变往往比其他基因型更为严重；例如，Kim13等研究者在一项研究中发现，在101名住院患者中，lb型所占的比例达到了39.9%。Reid及其团队的研究还发现，在28名肝细胞癌患者中，有19人（占比68%）感染了1b型病毒，而其他患者则多为包括1b型在内的混合感染。1b型HCV具有较强致病性的可能原因包括：首先，其E基因区存在一个高度变异的区域，随着时间的推移，其突变率会上升3至4倍，从而使病毒能够躲避宿主的免疫监控；其次，该病毒所表达或编码的蛋白具有显著的细胞毒性。然而，基因分型无法从病毒载量、饮酒、病程等影响肝脏疾病进展的其他相关因素中区分出来，因此作为单一因素，无法进行前瞻性研究。同时，也有研究者对这一观点提出了质疑。报道指出，HCV lb型患者不仅年龄普遍偏大，而且发病时间也比其他分型患者更早。研究者认为，HCV lb型引起的肝脏病变更为严重，这主要是因为其感染周期较长，而非其对肝脏的破坏力更强。Ortiz等人[161]指出，肝硬化与患者感染HCV病毒时的年龄、性别、ALT水平以及长期饮酒（超过50克/天）之间存在紧密联系。至于lb型与肝细胞癌之间的关联，则需要进一步探讨，包括构建体内和体外HCV复制以及蛋白表达模型等。

自HCV被发现以来，对干扰素治疗长期效果相关因素的探究成果显著。众多临床研究显示，影响a-干扰素抗病毒治疗反应的常见因素涵盖年龄、疾病持续时间、肝硬化状况、基因类型以及HCV RNA血清水平。多元分析结果显示，博1f J9]，lb型以及高浓度的HCV RNA是唯一能够独立预测对a一干扰素治疗无反应的指标。在普通Q一干扰素治疗持续24周的过程中，2型患者对干扰素的完全应答率达到了60%至70%。

研究显示，1型患者所占比例仅为10%至15%。在针对141例法国慢性丙型肝炎患者使用a-干扰素治疗的研究中，我们发现，lb型患者的持续有效率最低，仅为4%，而非lb型患者的持续有效率则达到32%；尤其是3a型患者，其持续有效率高达38%。相较于普通a-干扰素，长效干扰素（即聚乙二醇化干扰素）在治疗丙型肝炎方面表现出更显著的疗效，不过，不同基因型之间的疗效差异仍然存在。Perry等人研究发现，在HCV基因型1型患者中，对治疗的持续病毒学反应比例仅为28%，然而，对于基因型2或3型的患者，这一比例则上升至56%。在日本进行的研究中，针对lb型患者，发现HCV基因组的非结构区含有所谓的“干扰素敏感片段(ISDR)”。Dig等人的研究【21】表明，ISDR可能位于NS5A区域；然而，在欧美以及我国的研究中，并未观察到这一特定的基因片段。目前，这一发现的具体意义尚不明确。

丙型肝炎病毒的基因序列具有极高的变异性，这种特性主要体现在病毒不同基因型、亚型以及准种的变异上，并伴随着免疫逃逸现象。这些因素使得病毒能够避开宿主免疫系统的攻击，从而导致持续的病毒感染。同时丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义，这种特性也给丙型肝炎疫苗的研发工作带来了极大的挑战。在体液免疫与抗体领域的研究中，HCV的E区域被认为是激发中和抗体反应的关键抗原区域，因此，HCV的E区域以及它所编码的抗原——即包膜糖蛋白——成为了HCV疫苗研发的核心关注点。然而，这种包膜蛋白在各个病毒型别之间表现出显著的差异性。

5 结论

全球范围内广泛存在多种HCV基因型，其中主要分为6种基因型以及众多亚型。HCV基因分型作为流行病学的一个关键指标，对于HCV的诊断具有重要意义；它在HCV急性感染向慢性感染转变的过程中可能扮演着关键角色；然而，关于其与肝脏疾病严重程度之间关系的看法尚存在分歧；不同基因型对干扰素治疗的反应差异显著；源自HCV基因组高变区的蛋白质能够激发保护性免疫反应，这对开发有效的HCV预防疫苗构成了重大挑战。